Πρωτόκολλο μεθόδου δινιτροσαλικυλικού οξέος (D.N.S.) για τον προσδιορισμό της ενεργότητας του ενζύμου αμυλάση
Παρασκευή αντιδραστηρίου D.N.S.
Σε 700 ml διαλύματος NaOH 0,5 Ν, διαλύονται αργά και με ήπια θέρμανση 10 g 3,5-δινιτροσαλικυλικού οξέος. Στη συνέχεια προστίθενται 300 g τρυγικού καλιονάτριου (NaKC4O6.4H2O) και το μίγμα ογκομετρείται μέχρι τελικού όγκου 1000 ml. Το αντιδραστήριο έχει χρώμα σκούρο πορτοκαλί και είναι σταθερό για αρκετές ημέρες σε θερμοκρασία δωματίου.
Διαδικασία
- Παρασκευάζονται σε δοκιμαστικούς σωλήνες πρότυπα διαλύματα μαλτόζης συγκέντρωσης 0-10 μmoles/l.
- Σε κάθε δοκιμαστικό σωλήνα προστίθεται 1 ml αντιδραστηρίου D.N.S. και το μίγμα αναμιγνύεται για μερικά δευτερόλεπτα σε αναδευτήρα vortex.
- Τα δείγματα τοποθετούνται σε υδατόλουτρο Τ=100 °C για 5 min και εν συνεχεία ψύχονται σε θερμοκρασία δωματίου.
- Σε κάθε δείγμα προστίθενται 5ml απιονισμένου νερού και ακολουθεί ανάμιξη για μερικά δευτερόλεπτα σε αναδευτήρα vortex.
- Μετράται η απορρόφηση (A) κάθε δείγματος στα 540 nm.
- Χαράσσεται η πρότυπη καμπύλη αναφοράς.
- Μετρώνται οι απορροφήσεις των άγνωστων δειγμάτων και η συγκέντρωση των αναγωγικών σακχάρων προσδιορίζεται με βάση την πρότυπη καμπύλη αναφοράς.
Ενζυμική αντίδραση και προσδιορισμός ενζυμικής ενεργότητας
0.5 ml κατάλληλα αραιωμένου (σε ρυθμιστικό διάλυμα οξικού οξέος - pH=4,9) ακατέργαστου ενζύμου επωάζεται για 15 min σε θερμοκρασία 40 °C με 0,5 ml διαλύματος αμύλου 1% w/v. Στη συνέχεια προσδιορίζεται κατά τα ανωτέρω η παραγόμενη ποσότητα αναγωγικών σακχάρων που προέρχεται από την υδρόλυση του αμύλου. Ως μονάδα ενεργότητας (unit, U) του ενζύμου α-αμυλάση, ορίζεται αυθαίρετα η ποσότητα του ενζύμου που απαιτείται για να παραχθεί 1 μmole μαλτόζης σε 1min όταν το ένζυμο επωασθεί μαζί με το υπόστρωμα (διάλυμα αμύλου 1% w/v) σε pH=4,9 και Τ=40 °C.